微生物常見檢測方案

     微生物檢測常見的方法有：生長量測定法、微生物計數法、生理指標法和商業化快速微生物檢測等，本文列舉了一些常用檢測方法的的原理、應用范圍和優缺點。

      微生物生長意味著原生質含量的增加，所以測定的方法也都直接或間接的以次為根據，而測定繁殖則都要建立在計數這一基礎上。微生物生長的衡量，可以從其重量，體積，密度，濃度，做指標來進行衡量。

一、生長量測定法

1、體積測量法：又稱測菌絲濃度法。

原理：通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營養物，結果會有一定偏差。

2、稱干重法：

原理：利用離心或過濾法測定。一般干重為濕重的10-20%。稱干重發法較為煩瑣，通常獲取的微生物產品為菌體時，常采用這種方法，如活性干酵母（activity  dry  yeast, ADY）,一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。

3、比濁法：

原理：微生物的生長引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。該法主要用于發酵工業菌體生長監測。

4、菌絲長度測量法：

方法：對于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養基上測定一定時間內菌絲生長的長度。

二、微生物計數法

1、血球計數板法:

這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜于單細胞狀態的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數，并且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。

2、染色計數法：

為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數，而直接用血球計數板法又無法區分死細胞和活細胞的不足，人們發明了染色計數法。

3、比例計數法：

將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細胞）濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的細胞濃度。

4、液體稀釋法：

對未知菌樣做連續十倍系列稀釋，根據估計數，從最適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15只裝培養液的試管中，經培養后記錄每個稀釋度出現生長的試管數，然后查最大或然數表MPN（most probably number）得出菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物檢查。

5、平板菌落計數法：

這是一種常用的活菌計數法。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數，而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養，獲得了單克隆。

6、試劑紙法：

在平板計數法的基礎上，發展了小型商品化產品以供快速計數用。試劑紙法計數快捷準確，相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。

7、膜過濾法：

用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光，活細胞會發橙色熒光，而死細胞則發綠色熒光。

三、生理指標法

微生物的生長伴隨著一系列生理指標發生變化，例如酸堿度，發酵液中的含氮量，含糖量，產氣量等，與生長量相平行的生理指標很多，它們可作為生長測定的相對值。

1、測定含氮量：

大多數細菌的含氮量為干重的12.5%，酵母為7.5%，霉菌為6.0%。根據含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測氮氣法。

2、測定含碳量：

將少量（干重0.2-2.0 mg）生物材料混入1毫升水或無機緩沖液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加熱30分鐘后冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標準樣品做標準曲線。

3、還原糖測定法：

還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況，常用于大規模工業發酵生產上微生物生長的常規監測。

4、氨基氮的測定：

方法是，離心發酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02N的NaOH調色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應數刻，加入0.02N的使之變色，根據NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據培養液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。

5、其他生理物質的測定：

P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及產酸，產氣，產CO2（用標記葡萄糖做基質），耗氧，黏度，產熱等指標， 都可用于生長量的測定。也可以根據反應前后的基質濃度變化，最終產氣量，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。

四、商業化快速微生物檢測法

       微生物的檢測，其發展方向是快速，準確，簡便，自動化，當前很多生物制品公司利用傳統微生物檢測原理，結合不同的檢測方法，設計了形式各異的微生物檢測儀器設備，正逐步廣泛應用于醫學微生物檢測和科學研究領域。這些儀器和設備的生產廠家很多，產品各異，在此不做一一介紹，具體可查看各公司的產品說明。